QKI蛋白的原核表达、 纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

[摘　要]： 目的: 获得原核表达的RNA结合蛋白QKI7蛋白, 并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法: 将成功插入QKI7编码区cDNA的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3) 感受态细菌, 以IPTG诱导6×HisQKI7融合蛋白的表达, 分别经金属鳌合柱、 反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDSPAGE和Western blot鉴定后, 应用纯化的融合蛋白, 分别以弗氏佐剂、 聚丙烯酰胺凝胶、 NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并以Western blot进行检测。结果: 经表达并纯化的QKI7蛋白纯度达到95%以上, 应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度, 特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论: 成功地表达并纯化了QKI7蛋白, 并制备了高滴度、 高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。
[英文摘要]：
[关 键 字]：QKI7; 原核表达; 蛋白纯化; 多克隆抗体
[论文正文]：

　　QKI是属于STAR家族的一种RNA结合蛋白,在进化过程中高度保守, 在神经系统的髓鞘形成、 胚胎发育、 心血管系统的发育等方面起着重要的作用。qki基因不同部位的突变体小鼠可以表现在出生前死于心血管肌肉系统发育障碍, 或于出生后10 d表现为快速的震颤以及到了成年强直性惊厥的发作[1-3]。Pilotte 等[4]发现QKI7可以引起成纤维细胞和原代培养的大鼠少突胶质细胞发生凋亡, QKI5 和QKI6不但不能诱导凋亡, 反而可以与QKI7形成二聚体, 并转移到细胞核内, 抑制QKI7的致凋亡作用。为了研究QKI在外界不同信号刺激下在炎症发生、 血管生成过程中表达水平的变化, 我们表达和纯化了6×HisQKI7融合蛋白, 并制备了高特异性的多克隆抗体[5]。同时还比较了利用3种不同的免疫佐剂制备QKI多克隆抗体的效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7含有编码QKI7 cDNA序列, 由美国Emory大学药理系教授冯越惠赠。Ni金属鳌合柱（Sepharose Fast Flow）、 反相层析柱（source 30RPC）和强阴离子柱（source 30Q）均购自Pharmacia 公司。纯种新西兰白兔由本校实验动物中心提供。弗氏佐剂购自Gibco BRL 公司。HepG2细胞、 Hy906细胞为本室保存的引自美国ATCC的标准细胞株。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细菌的发酵和裂解 将6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7转化的大肠杆菌BL21(DE3)接到5 mL的LB培养基中, 30℃培养过夜, 转接细菌到500 mL 2×YT培养基中, 30℃培养10 h无菌接种于30 L发酵罐中（内有8 L培养液, 不含抗生素）37℃培养6 h后开始流加补料, 9 h后加入IPTG至终浓度05 mmol/L开始诱导, 诱导4 h后停止发酵。4000 r/min离心25 min, 收集沉淀, -70℃保存备用。取发酵细菌, 按照细菌和裂解液为1∶8的比例加入裂解(20 mmol/L Tris pH10, 3 mL/L巯基乙醇, 6 mol/L盐酸胍), 不停搅拌, 室温过夜。8000 r/min离心30 min, 收集上清; 然后用超声波发生器以1500W的功率超声, 超声9 s间歇15 s, 一个循环超声90次, 攻击超声5个循环, 待用。

　　1.2.2 亲和层析纯化QKI7 金属鳌合柱经过A液(20mmol/L TrisHCl pH80, 150 mmol/L NaCl, 6 mol/L脲)平衡后, 取第一步准备的上清直接采用金属鳌合柱层析。上样流速为8 mL/min; 上样完成后用A液流洗至基线, 直接用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 150 mmol/L NaCl, 6 mol/L脲, 200 mmol/L咪唑)洗脱, 收集目的蛋白峰, 准备下一步反相层析纯化。

　　1.2.3 反相层析纯化QKI7 以8 mL/min的流速用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1 mL/L巯基乙醇, 5 mol/L脲, 500 mL/L异丙醇)流洗30 mL, 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1 mL/L巯基乙醇, 5 mol/L脲)平衡层析柱至基线, 调整紫外吸收至零点。用8 mL/min的流速上样, 上样结束后用A液流洗至基线, 采用20% B液流洗2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak1, 再用75% B液洗脱2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak2, 最后用100% B液洗脱2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中。收集peak2, 准备阴离子柱纯化。

　　1.2.4 强阴离子层析纯化QKI7 以8mL/min的流速用B液(20mmol/L TrisHCl pH80, 1mL/L巯基乙醇, 5mol/L脲, 1 mol/L NaCl)流洗30 mL, 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1mL/L巯基乙醇, 5 mol/L脲)平衡层析柱至基线, 调整紫外吸收至零点。用8 mL/min的流速上样, 上样结束后用A液流洗至基线, 采用7% B液流洗2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak1, 再用20% B液洗脱2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak2, 最后用100% B液洗脱2个柱体积, 收集蛋白峰, 记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中, 纯度在95%左右, 4℃保存备用。

　　1.2.5 抗原的Western blot检测 将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物经SDSPAGE并转膜后, 用100 g/L的脱脂奶粉（TBST）封闭2 h, 一抗为anti6×His mAb(1∶1000稀释), 二抗为羊抗鼠HRPIgG（1∶500稀释）, 依次加DAB和H2O2显色。

　　1.2.6 抗体的制备 将6只新西兰大白兔随机分成3组, 用纯化的6×His 融合蛋白分别以弗氏佐剂、 聚丙烯酰胺凝胶、 NC膜作为佐剂常规免疫, 每次免疫PET32b(+)QKI7融合蛋白200 μg。首次免疫后1月进行第2次免疫, 其后间隔2周进行第3次免疫, 共3次。其中弗氏佐剂组第1, 第2次免疫分别用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂及200 μg抗原等体积混合, 于腋下和腹股沟区注射, 第3次免疫用200 μg纯抗原于耳缘静脉直接注射。聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组3次免疫均为腋下和腹股沟区注射。3组最后1 次免疫2周后, 从兔耳静脉采血1 mL, 以间接ELISA 法检测血清抗体效价, 其中弗氏佐剂组抗体效价高于1∶105, 聚丙烯酰胺凝胶组和NC膜组抗体效价低于1∶102, 颈动脉插管分别收集血清。血清在4 ℃孵育过夜, 离心收集上清, 分装冻存于-70以备用。

　　1.2.7 3种不同的免疫策略抗体特异性的鉴定 用过表达QKI7的HepG2细胞蛋白提取进行SDSPAGE 后, 电转移至NC膜上, 以100 g/L脱脂奶粉封闭过夜, 用3组抗QKI血清(1∶700稀释)进行Western blot分析。

　　1.2.8 所获得抗体对内源性抗原的检测 用Hy906细胞蛋白提取物进行SDSPAGE 后, 电转移至NC膜上, 以100 g/L脱脂奶粉封闭过夜, 用弗氏佐剂组抗QKI血清(1∶1000稀释)进行Western blot检测。

　　2 结果

　　2.1 6×His融合蛋白的表达与纯化抗原的鉴定 经IPTG 诱导后, 在PET32b(+)QKI7转化菌裂解液中, 新出现1条Mr约40000的蛋白带(图1), 与预期的6×HisQKI7融合蛋白Mr相符。经金属鳌合柱（图2）, 反相层析柱（source 30RPC）（图3）, 强阴离子柱（source 30Q）（图1）层析法纯化的上述蛋白, 在SDSPAGE后几乎为单一条带, 纯度达到95%以上。[page]

　　图1 6×HisQKI7融合蛋白的诱导表达和纯化（略）

　　1: 未用IPTG诱导; 2: IPTG诱导4 h; 3: 纯化的6×HisQKI7.

　　图2 6×HisQKI7融合蛋白经金属鳌合柱后纯化结果（略）

　　1: 金属鳌合柱层析产物; M: 蛋白marker.

　　图3 6×HisQKI7融合蛋白经反相层析柱纯化结果（略）

　　1: 反向层析柱柱层析物; M: 蛋白marker.

　　2.2 抗原的鉴定 将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物作Western blot进行鉴定（图4）, 未诱导细菌的裂解产物可以看到1 条很弱的反应带, 最终纯化的目的蛋白产物可以分别看到明显的蛋白带反应。证明所纯化的蛋白是我们所要的带有His标签的融合蛋白。

　　图4 抗His抗体对纯化后抗原的Western blot分析（略）

　　1: 未诱导细菌的裂解产物; 2: 纯化的6×HisQKI7融合蛋白fusion protein(12 μg); 3: 纯化的6×HisQKI7融合蛋白(2 μg).

　　2.3 3种不同的免疫策略抗体特异性的鉴定 在Western blot中, 3种不同的免疫策略组中只有弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶700稀释）与在HepG2细胞中过表达的QKI5蛋白起反应, 而聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组不与过表达QKI5蛋白的HepG2细胞裂解产物反应(图5) 。该组抗体能与HepG2细胞蛋白提取物中1 条Mr约40000的蛋白带反应, 与QKI5的Mr相符。

　　2.4 所获得抗体对内源性抗原的检测 用弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶1000稀释）对Hy906细胞的蛋白提取物做Western blot, 该组抗体能与Hy906细胞蛋白提取物中1条Mr约40000的蛋白带反应, 与QKI5的Mr相符（图6）。说明我们所获得的QKI多克隆抗体能检测内源性抗原的表达。

　　图5 抗QKI多克隆抗体的Western blot 鉴定（略）

　　1, 2: 聚丙烯酰胺凝胶组多克隆抗体; 3, 4: NC膜组多克隆抗体; 5, 6: 弗氏佐剂组多克隆抗体.

　　图6 抗QKI多克隆抗体对内源性抗原的Western blot鉴定（略）

　　1, 2: 抗内源性QKI5蛋白; 3: 蛋白 marker.

　　3 讨论

　　QKI不同的剪接体之间有90%以上的氨基酸同源序列, 有几乎相同的抗原表位, 因此利用6×HisQKI7融合蛋白所制备的多克隆抗体可以识别QKI不同的剪接体, 其实是针对各种QKI蛋白的多克隆抗体[6]。为了进一步研究QKI的功能, 我们表达、 纯化了6×HisQKI7融合蛋白, 并制备了高效价、 高特异性的抗QKI的多克隆抗体, 为从蛋白水平对QKI进行研究提供了有力的工具[7]。实验中6×HisQKI 融合蛋白的His标签与Ni金属离子鳌合柱的亲和力很低, 以致于经过一次亲和层析后所收集的目的蛋白峰中还是含有很高比例的杂蛋白。我们又根据QKI7蛋白的氨基酸序列和蛋白质疏水性, 等电点等性质设计纯化方案, 利用常用的反相柱层析和强阴离子柱层析才达到目的蛋白在95%比例以上的纯化效果。分析原因可能是QKI蛋白的氨基酸序列和空间构象影响了His标签与Ni金属离子鳌合柱的亲和力, 所以一步纯化很难达到预期的效果。此外,